产品描述

RO-3306是一种ATP竞争性的选择性 CDK1 抑制剂，Ki 为20 nM，选择性是其他各种人类激酶的15倍多。

靶点（IC50 & Targe）

CDK1,20nM(Ki)

ERK,1980nM(Ki)

PKA,>2000nM(Ki)

PKCδ,318nM(Ki)

SGK,497nM(Ki)

体外研究

RO-3306抑制CDK1/cyclin B1，CDK1/cyclin A，CDK2/cyclin E，和CDK4/cyclin D活性，Ki分别为35 nM，110 nM，340 nM，和>2000 nM。HCT116，SW480，和HeLa细胞用RO-3306处理20小时导致细胞周期完全阻滞在G2/M期。HCT116和SW480的增殖被RO-3306有效阻断。RO-3306似乎在癌细胞(HCT116和SW480)中比在非致瘤性细胞(MCF 10A和MCF 12A)中具有更强的促凋亡作用。[1] 10 μM 浓度的RO-3306有效阻止卵母细胞成熟。[2]

激酶实验

CDK试验:

CDK1 cyclin B1，CDK1 cyclin A，CDK2 cyclin E，和CDK4 cyclin D通过均相时间分辨荧光法在96孔格式中测量。实验缓冲液包含25 mM Hepes，6.25 mM MgCl2，0.003% Tween 20，0.3 mg/mL BSA，1.5 mM DTT，和如下含量的ATP: 162 μM (CDK1)，90 mM (CDK2)，或135 μM (CDK4)。CDK1和CDK2缓冲液包含10 mM MgCl2。测试化合物在20 μL实验缓冲液中稀释为它们终浓度的3倍，反应通过加入40 μL包含pRB底物(0.185μM)的试验缓冲液起始。板在37°C下连续搅拌培养30分钟，反应通过加入15 μL 含1.6μM 抗磷酸pRB抗体(Ser-780)的25 mM Hepes，24 mM EDTA，和0.2 mg/mL BSA终止。再振荡培育30分钟后，加入15μL 包含3nM Lance-Eu-W1024-labeledanti-rabbitIgG和60 nM Alophycocyanin共轭的抗-His-6 抗体的25 mM Hepes，以及0.5 mg/mL BSA，培育1小时。板在Victor-V多标阅读器上以340 nm激发波长和615 nm与665 nm发射波长读取数据。IC50值根据665 nm下的读数值进行计算，并归一化为615 nm下铕的读数值。Ki值根据公式Ki= IC50/(1 + S/Km )计算，其中S是试验中ATP浓度，Km是相对ATP的Michaelis-Menten常数。对激酶组的抑制活性通过IMAP测定技术确定。

细胞实验

Cell lines: MDA-MB-231 细胞系

Concentrations: 20 μM

Incubation Time: 72 h

Method: 对数生长期细胞(25,000)接种于96孔板，在37℃培养箱中与CO2一起培养，24小时后，给予不同浓度RO-3306以测定达到50%生长抑制(IC50)的药物浓度。MTT (20 μL，包含5mg/mL储备溶液的生理盐水)加入每孔中，细胞培养4小时。移除上清液，来自活细胞的甲瓒晶体溶解在200 μL无水DMSO中。吸光度使用550模式酶标仪在565 nm波长下检测。

(Only for Reference)

参考文献

[1] Vassilev LT, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(28), 10660-10665.

[2] Jang WI, et al. Anim Reprod Sci. 2014, 144(3-4), 102-108.

[3] Xia Q, et al. Int J Oncol. 2014, 44(3), 735-744.