产品描述

JIB-04是一种广谱的选择性Jumonji histone demethylase抑制剂，无细胞试验中对JARID1A，JMJD2E，JMJD3，JMJD2A，JMJD2B，JMJD2C和JMJD2D的IC50分别是230 nM，340 nM，855 nM，445 nM，435 nM，1100 nM和290 nM。

靶点（IC50 & Targe）

JARID1A,230nM

JMJD2A,445nM

JMJD2B,435nM

JMJD2D,290nM

JMJD2E,340nM

体外研究

JIB-04 以癌症选择性的方式引起转录改变，包括下调增殖基因，上调抗增殖/前凋亡基因。JIB-04能够以IC50低至10 nM的水平阻碍肺癌、前列腺癌细胞系的增殖，同时在HBECs和PrSCs/PrECs中产生较少的抗增殖活性。[1]

体内研究

在两个小鼠异种移植模型（H358或A549）中，JIB-04减少肿瘤生长，降低肿瘤中Jumonji组蛋白脱甲基酶的活性，延长肿瘤患者生存时间。[1]

激酶实验

Jumonji脱甲基酶/脯氨酰羟化酶/LSD1活性检测:

活性JMJD2E氨基酸1-350从E.coli中纯化，体外环境中与α-酮戊二酸，5-10 μM铁离子，抗坏血酸，组蛋白肽段基质一起使用，偶联反应时加入甲醛脱氢酶和NAD+来定量NADH的生成量，或使用Epigentek kit P-3081。组蛋白脱甲基反应结果通过Western分析来定量，构建His-tagged hJMJ2D氨基酸1-350表达体系，E.coli表达产物通过Qiagen Ni-NTA琼脂糖手册进行纯化。蛋白用50 mM TrisHCl pH 7.8+0.3 M NaCl + 10%甘油+200 mM immidazol洗脱，后用20 mM TrisHCl pH 7.4，0.15 M NaCl，0.2 mM PMSF，0.5 mM DTT，8%甘油透析。蛋白分装，速冻、储存在-80°C。Western blot中，~1.5 μg酶与0.3 μg H3K9me3基质（Active Motif #31213），10 μM (NH4)2Fe(SO4)2，1 mM α-酮戊二酸，2 mM L-抗坏血酸钠在50 mM pH 7.9溶液中混合，与溶媒或药物在37°C孵育30min-2hrs。加入SDS loading buffer后，煮沸，样品在NuPage 4-12% Bis-Tris胶上电泳，转膜，用Upstate #07-523处理硝化纤维素膜以检测H3K9me3。H3总信号是通过Active Motif #39763和连接IRDye 680的驴抗兔IgG（二抗, LI-COR # 926-32223），在Odyssey Infrared成像系统中获取图像。体外IC50检测和竞争性试验，100-200 ng纯化蛋白与溶媒、JIB-04或类似物共孵育，通过ELISA（H3K9me3去甲基作用：Epigentek kit P-3081，H3K4me3去甲基作用：P-3083，H3K27me3去甲基作用：P-3085）检测活性，反应液包含50mM Hepes pH 7.5，0.01% Tween 20，120nM (NH4)2Fe(SO4)2，1 mMα-酮戊二酸，2 mM L-抗坏血酸钠，50ng肽段基质。最终酶浓度分别为：206 nM JMJD2A，12 nM JMJD2B，60 nM JMJD2C，90 nM JMJD2D E.coli，30 nM JMJD2D Sf9，30 nM JMJD2E，30 nM Jarid1a，35 nM JMJD3。E.coli表达的hJMJD2A（氨基酸1-350）纯化后以每孔400 ng的量进行检测。通过GraphPad Prism软件计算IC50和进行曲线拟合。需要注意的是在基质竞争性试验中， 应该使分析处于线性范围并且不超出ELISA板的结合能力。细胞裂解物的H3K9me3脱甲基酶活性的直接测定：超声处理细胞（细胞接种浓度为2x10E+06/10cm板）或肿瘤PBS匀浆（3x4 sec），等量的蛋白与组蛋白H3K9me3基质在反应液中37°C孵育2h后，用Epigentek kit P-3081进行免疫检测。500 ng E.coli表达的PHD2纯化蛋白，溶于40mM Tris pH 7.4，100mM NaCl，20% glycerol，5mM β-mercapto-ethanol，10mM 麦芽糖备用。从HIF-1 ODD分离出的生物素化的肽段固定在亲和素包裹的96孔板中。酶与被试药物在反应液（20 mM Tris-Cl pH 7.5，5 mM KCl，1.5 mM MgCl2，2 mM DTT，0.12 μM硫酸亚铁，0.5 mM戊邻酮二酸盐，1 mM抗坏血酸）中室温孵育45min。α-酮戊二酸的竞争性类似物DMOG作为抑制作用的阳性对照。肽段羟基化是通过对羟基化HIF肽表位使用多克隆兔抗体，再加入连接羊抗兔HPR的二抗。EnVision上读取发光值。LSD1重组蛋白活性通过使用Epigentek kit P-3075检测。

细胞实验

Cell lines: 人肺癌细胞系(LCa)，原代或非致癌细胞系HBECs，前列腺癌(PCa)，原代前列腺基质细胞(PrSC)和前列腺上皮细胞(PrEC)。

Concentrations: ~10 μM

Incubation Time: 96小时

Method:以每孔1500-3000细胞接种至96孔板，次日开始以递增浓度的化合物处理细胞4天后，用MTS标准分析法用Promega’s Cell Titer或Cell Titer-Glo试剂测试细胞活性，使用Spectra Max或FlouroStar Omega酶标仪读取490 nm和650 nm的吸光度。每种细胞系进行2-5次独立测试，每次包含4-8个测试孔。IC50 通过DIVISA软件计算得到。

(Only for Reference)

动物实验

Animal Models: H358或A549小鼠异种移植模型

Formulation: 12.5%聚氧乙烯蓖麻油，12.5% DMSO水性悬液(A549，灌胃)，10% DMSO 90%芝麻油(H358，腹腔注射)

Dosages: 110 mg/kg (H358，腹腔注射)，55 mg/kg (A549, 灌胃)

Administration: 灌胃或腹腔注射

(Only for Reference)

参考文献

[1] Wang L, et al. Nat Commun. 2013, 4, 2035.