产品描述

CW069 是一种变构选择性microtubule motor protein HSET抑制剂，IC50为75 μM, 其选择性显著高于KSP.

靶点（IC50 & Targe）

HSET,75μM

体外研究

CW069增加含有多余中心体的N1E-115细胞中多级纺锤体，而不改变正常人皮肤成纤维细胞中两极纺锤体的形态。CW069抑制癌症N1E-115细胞的生长，IC50 为10 μM，但是不影响NHDF或原代人骨髓细胞的生长。[1]

激酶实验

体外酶催化的ATPase试验:

优化该协议用于全长，N端，6His标记的HSET 和KSP，并测量MT-刺激的蛋白质活性。通过丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶反应将ATP的水解与NADH的氧化耦合，从而以分光光度法观察HSET/KSP 的Gsp合成酶活性的抑制。试验通过将纯化的Gsp合成酶/酰胺酶(12.8 nM)加入试验混合物起始，试验混合物包含以下成分(终浓度)：6 nM蛋白质，0.07 mg/ml MTs (大学生物制剂)，1.56 mM 谷胱甘肽，10 mM 亚精胺，2 mM ATP，2.7 mM MgCl2，1 mM磷酸(烯醇)-丙酮酸，0.2 mM NADH，50 μg/ml 乳酸脱氢酶，100 μg/ml 丙酮酸激酶，以及不同浓度的抑制剂，均溶解在50 mM Na PIPES (pH 6.8)中，温度为37°C。ADP-Glo检测试验(Promega)根据制造商的指示进行。所有化合物使用多点BioMek Nxp进行。板使用Pherastar酶标仪读取。

细胞实验

Cell lines: N1E-115细胞，NHDF和初级人骨髓细胞

Concentrations: ~400 μM

Incubation Time: 72小时

Method: 细胞在DMEM中在37°C和5% CO2下培养，用10%胎牛血清(FCS)增补。在磺酰罗丹明B比色(SRB)试验中，所有使用的化合物溶解在DMSO中，并在培养基中稀释为0.2% DMSO的终浓度。对于SRB试验和活细胞成像，将细胞以2,500细胞/孔的密度接种在96孔板。24小时后，细胞用化合物处理72小时，每个浓度重复3个孔。对于SRB试验，细胞随后用三氯乙酸(TCA)固定，并用SRB着色。荧光性使用Infinite 200 PRO板阅读器在545 nm波长下定量。化合物处理的孔与溶剂对照孔进行比较，导致50%溶剂对照组细胞生长的化合物浓度定为IC50浓度，使用Graphpad PRISM 6计算。每个试验至少进行三次生物学平行测定。

(Only for Reference)

参考文献

[1] Watts CA, et al. Chem Biol. 2013, 20(11), 1399-1410.