茶叶中草甘膦的测定及衍生过程五大影响因素优化-百灵威

草甘膦（GLY）是一种高效、低毒、廉价的内吸传导型广谱灭生性除草剂，被广泛施用于茶园等农业生产中。随着草甘膦的广泛使用，其在茶叶、水果等植物源食品中残留量的检测越来越受到关注。

草甘膦及其代谢物氨甲基膦酸具有极性强、易溶于、难溶于各种有溶剂，这给常规检测带来了极大的困难和挑战。

百灵威草甘膦专用柱应用方案包含完善的前处理条件及衍生条件优化过程，通过对红茶、绿茶、青茶等样品进行草甘膦检测验证，实验结果令人满意。

样品前处理

一、样品提取

准确称取经粉碎的茶叶1.0g于50mL离心管中，加入浓度为10μg/mL草甘膦内标100μL，再加入10mL水，涡旋混匀15min，超声提取15min，以10000r/min离心5min，待净化。

二、样品净化（9333551草甘膦专用柱 , 填料500 mg, 柱体积6 ml）

移取5mL上清液至50mL离心管中，加入5mL二氯甲烷，涡旋混匀5min，以10000r/min离心5min，取2.5mL上清液过固相萃取柱（使用前用3mL甲醇和3mL水活化），弃掉前端几滴液体，再收集后续流出液，待衍生。

三、衍生

取1.0mL上述的净化液，加入0.2mL50g/L硼酸钠缓冲溶液，涡旋混匀，再加0.2mL 10g/L FMOC-Cl丙酮衍生液，涡旋混匀后置于45℃下衍生2h，以10000r/min离心5min，过0.22μm滤膜，上机测试。

四、标曲配制

1、吸取一定量的混合标准溶液和同位素内标溶液，用水稀释定容至1.0mL，使每毫升混合标准工作液含有同位素内标100ng/mL。
2、加入50g/L硼酸钠缓冲溶液0.2mL，混匀，再加吸取一定量的混合标准溶液和同位素内标溶液，用水稀释定容至1.0mL，使每毫升混合标准工作液含有同位素内标100ng/mL。
3、加入50g/L硼酸钠缓冲溶液0.2mL，混匀，再加入10g/L FMOC-Cl溶液0.2mL，涡旋混匀后同样品置于45℃下衍生2h，配制成上机浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL。

分析检测

一、仪器条件

1、液相色谱条件：
色谱柱：C18(2.1mm×100mm,3μm)
流动相：A：5mmol/L乙酸铵溶液 B：乙腈
流速：0.4mL/min
柱温：30℃
进样量：5μL
洗脱程序：梯度洗脱
表1 梯度洗脱程序

2、质谱条件：
离子源：HESI
电喷雾电压：3500V
鞘气压力：40arb
辅气压力：10arb
离子传输管：260℃
辅气温度：350℃
表2 组分、保留时间及特征离子（*为定量离子）

二、检测结果

表3 加标回收率结果

图1 添加水平为0.50mg/kg的铁观音总离子流图

衍生过程优化

一、衍生剂浓度

如图2所示，考察衍生剂浓度分别为1g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L和20g/L，添加量为0.2mL时标液中目标物的峰面积变化，从图中可以看出衍生剂加入量≥6g/L时，目标物峰面积无明显变化。考虑到样本中的基质会消耗一定量的衍生剂，建议适当增大衍生剂的浓度，方案中衍生剂的浓度为10g/L。

图2 衍生剂浓度对目标物的影响

二、衍生时间

考察不同衍生时间，0.5~4小时（衍生温度40℃）及12小时（室温过夜20℃）。结果如图3所示，草甘膦和氨甲基磷酸在衍生时间≥2小时，目标物峰面积无明显变化，室温过夜有利于衍生完成。综合考虑时效性，方案中衍生时长为2小时。

图3 衍生时间对目标物的影响

三、衍生温度

考察不同温度对衍生的影响，衍生温度大于35℃时，草甘膦和氨甲基膦酸以及内标的峰面积无太大差异，方案中选择45℃为衍生温度。

图4 衍生温度对目标物的影响

四、硼酸钠浓度

如图5，不同浓度硼酸钠缓冲溶液对草甘膦和氨甲基膦酸以及内标的衍生影响较小，50g/L硼酸钠缓冲溶液已经能获得较为理想的衍生效果，而浓度高的硼酸钠溶液会污染质谱，方案采用50g/L的硼酸钠。

图5 硼酸钠浓度对目标物的影响

五、衍生剂存储时间

考察不同存储时间的FMOC-Cl对目标物的影响，实验结果如图6所示。FMOC-Cl存储时间对于草甘膦及其内标影响较小，但对氨甲基膦酸有显著影响，储存时间越长峰面积越小。

图6 衍生剂存储时间对目标物的影响

说明：
1.不同类型的茶叶所含干扰基质不一样，实际处理时可对方法进行适当调整，如对颜色深的提取液可多次加入二氯甲烷净化，且在衍生时提高衍生剂的浓度。
2.前处理中可加入微量饱和醋酸铅溶液（如20μL）,用于沉淀酚类干扰物，此时可获得较为澄清的上机溶液。值得注意的是，醋酸铅的加入会导致氨甲基磷酸响应变低，但不会影响草甘膦的响应，可综合考虑选择性使用。
3.仪器条件优化，草甘膦和氨甲基磷酸受基质抑制影响严重，灵敏度低的仪器在优化时很难找到相应的母离子，此时，可直接参考文献或者标准输入同类型仪器的参数。

品名	CAS	货号
Glyphosate, 96% 草甘膦	1071-83-6	176839
(Aminomethyl)phosphonic acid, 99%, reference material 氨甲基膦酸	1066-51-9	912771
Glyphosate 1,2-13C2 15N 100 μg/mL in Water 草甘膦13C215N	/	DRE-XA14050100WA
Dichloromethane, 99.8% 二氯甲烷	75-09-2	947068 危化品
Sodium tetraborate decahydrate, 99.5%, for analysis,PH:9.0 - 9.5 (5% soln.at 25 ℃) 四硼酸钠盐十水合物	1303-96-4	221667
Acetonitrile, 99%, for analysis 乙腈	75-05-8	980995 危化品
Ammonium acetate, 98%, for analysis 乙酸铵	631-61-8	925211
Cartridges for glyphosate testing, bed wt. 500 mg, volume 6 ml, 30 pcs/pack 草甘膦专用柱	/	9333551
Nylon 66 syringe filter, non-sterile, 13 mm, 0.22 µm, green, 200 pcs/pack 有机系尼龙66 针式过滤器	/	9215892
PTFE centrifuge tube, 50 ml 聚四氟乙烯离心管	/	991694
Sample vial, 2mL, 9 mm, clear glass screw thread vials with write-on spot 样品瓶	/	922054
SPE vacuum manifold, 12-port model 固相萃取装置	/	991838
Single-channel mechanical pipettor, Volume range: 50 - 200 μL, Increment: 1.0 μL 单道手动可调移液器	/	997681
Pipette tips, 200 μL, yellow, low Retention, 1000 tips/pack 移液器吸头	/	1438546